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13817140470更新時間:2017-11-17 瀏覽次數(shù):2882
逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)在實驗室中經(jīng)常被用于檢測和量化樣本中的RNA表達。實驗的*步是通過逆轉(zhuǎn)錄(RT)將不穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)化為互補的DNA(cDNA)。實際上,RT是許多用于研究RNA的分子生物學技術的*步,因為將不穩(wěn)定的RNA轉(zhuǎn)換為更穩(wěn)定的DNA會使分析更容易、更可靠。對于RT-PCR,有一步法和兩步法。
在一步法RT-PCR中,RT反應和PCR擴增是在同一管中進行。將RNA模板添加到試管中,加有兩種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶),以及完成反應的所有必須組分。逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生cDNA產(chǎn)物,然后逆轉(zhuǎn)錄酶和cDNA變性,DNA聚合酶擴增cDNA。在一步法中,RT反應由基因特異性引物啟動。因此,只有感興趣的區(qū)域被反向轉(zhuǎn)錄,然后進行擴增。
在兩步法RT-qPCR中,RT反應與PCR擴增單獨進行。首先,RNA添加到反應混合物中,混合物包括逆轉(zhuǎn)錄酶和oligo-dTs (結(jié)合mRNA的poly-A尾巴)或隨機六聚體(或兩者都有),合成cDNA。下一步,從管子中取出少量cDNA,置于一個新管中,作為PCR的模板與基因特定的引物一起混合。因為RT反應采用隨機啟動或由oligo-dTs進行啟動,總RNA或總mRNA在RT步驟中被轉(zhuǎn)錄。盡管這兩種方法都能得到zui終的結(jié)果,但是每種方法都有優(yōu)缺點。選擇哪種方法取決于各種因素。如下總結(jié)它們的優(yōu)缺點。
一步法RT-PCR:
優(yōu)點: 只需一步,反應發(fā)生在單管中,速度比兩步法更快,而且需要較少的準備和操作時間。
處理大量樣品時易于操作,減少污染的機會。
整個cDNA樣品都被擴增,靈敏度更高。
缺點: 同一樣本只有有限數(shù)量的目的基因被擴增。另一個挑戰(zhàn)是組分的兼容性,因為一步法需要轉(zhuǎn)錄和擴增之間的平衡。
適用性:當時間對于實驗很重要時,一般采用一步法。例如,迅速的一步法是RNA病毒檢測的好方法,結(jié)果可以很快得到。也適用于高通量分析。 由于該方法采用基因特異性引物,所以通常是分析低表達水平基因的較好選擇。此外,一步法是非常的,需要測量表達水平上的細微差異時這是一種常用的方法。
兩步法RT-PCR:
優(yōu)點: 可以分析同一樣本的多個目標。
逆轉(zhuǎn)錄步驟將樣本中所有的RNA轉(zhuǎn)換為cDNA,可以儲存cDNA用于后續(xù)實驗,檢測大量基因。
能夠分別優(yōu)化RT和PCR步驟,可以更好地控制實驗過程。
因為只有少量的轉(zhuǎn)錄材料用于PCR,任何可能從RNA分離到RT反應的抑制劑(如乙醇、苯酚或胍鹽)都被稀釋了。
缺點:它更耗費時間,且?guī)砦廴镜目赡苄愿摺T步驟轉(zhuǎn)錄所有的RNA以相同的效率,選擇這種方法時,應該考慮到啟動會影響qPCR的結(jié)果。例如,以oligo-dTs 和隨機六聚體啟動反應可能會帶來不同的結(jié)果。因此,對于每個RT反應應該使用相同的條件。
適用性:選擇兩步方法的zui常見原因是對同一樣本的多個目標進行分析。第二,當RNA的存儲是個問題時,是進行兩步RT-PCR,因為cDNA在-20°C是穩(wěn)定的。此外,當起始材料有*,使用兩步RT-PCR ,通常會有更高的cDNA產(chǎn)量。
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